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抗体革命迫在眉睫

2015-12-16

2015-12-16 来源:lifeomics

虽然抗体是生物科学领域的主力,但是它的可靠性一再让研究人员处于窘境。随着理解的加深以及技术的发展,学界有望克服这一问题。

一只小鼠提醒了Clifford Saper这样一个事实:抗体正在误导科学界。在1994年到2011年间,Clifford Saper担任《比较神经学》(Comparative Neurology)杂志的主编。在此期间,他看到了一大堆依靠抗体来标记神经递质及其受体位置的论文。2000年前后,基因敲除小鼠在生物领域大受欢迎,但结果令人不安。按道理说,基因敲除动物的染色结果应该和对照组小鼠的染色结果存在很大差别。但很多时候结果相同。据如今是波士顿贝丝·以色列·迪肯尼斯医疗中心(Beth Israel Deaconess Medical Center,BIDMC)神经部门主席的Saper回忆,他们发现越来越多的论文因此被撤稿。同时Saper也意识到,他们缺乏系统的方法来评估这些使用抗体的论文。

于是单个杂志革命开始了。Saper和编辑部的同事们提出了一条规则,要求作者提供论文中使用的抗体的广泛验证数据。据Saper回忆,这条政策对文章的严谨性有很大好处,但对于论文的投稿不利。“很多作者会觉得麻烦,会选择投稿到其它杂志。”但Saper坚持这一原则。他的努力最终形成了JCN抗体数据库,一个包含几千个可信赖的神经解剖学抗体的清单。

如今,医学研究者仍然不断遭遇抗体悲剧。最常见的悲剧是骗人的抗体:购买的用于检测蛋白X的抗体优先与蛋白Y结合(甚至可能完全不与X结合)。另一个悲剧是可重复性差:用新抗体重复以前的实验,发现结果无法重复。一个好项目因此搁浅(见文末:处于困境的抗体市场)。

但技术的进步和科学界的需求变化将会终结这个抗体泥潭。

抗体是生命科学领域最常用的工具之一。最普遍的用法是在 Western blot中揭示细胞或组织样本中特定蛋白质的表达量的多少。此外,它们也被用于免疫组化和免疫荧光染色,以便于在显微镜下可视化地观察蛋白,以及其它各类基于抗体会与特定生物分子结合的实验。据网上生物试剂商城Biocompare 2015年发表的一份报告估计,科研用抗体市场规模达到25亿美金,并且仍在增长。抗体的选择也让人眼花缭乱——有数以百计的抗体供应商。

在这一巨大市场的背景下,抗体的不可靠性问题非常让人警醒。特异性不足、敏感度和批次差异性等导致了错误的科研发现和大量的科研精力浪费。抗体的不可靠性造成了癌症、代谢、老化、免疫学和细胞信号转导以及任何研究复杂的生物分子的领域的巨大损失。因抗体而造成的、在时间和资源方面的浪费非常巨大。据估计,每年因购买质量差的抗体导致的损失达到8亿美金,更不要说所造成的无数的错误结论、不可解释的(或曲解)实验,以及浪费了的病人样本和增加了的徒劳的研究时间。

瑞典皇家理工学院(Royal Institute of Technology)的研究员Mathias Uhlén表示,因抗体而造成的挫败已经太多了,是时候做出改进了。“学界对解决这个问题怀有很大兴趣。”

势在必行

对抗体的不满意激励了各领域人士采取行动。今年9月,Uhlén主持了由人类蛋白质组组织(Human Proteome Organization,总部在温哥华,一个国际财团支持的、研究蛋白质的大型项目)举办的抗体验证工作组成立大会。同月,美国实验生物学学会联合会( Federation of American Societies for Experimental Biology)主办的圆桌会议也探讨了抗体问题,预计明年年初发布抗体选择建议。美国国立卫生研究院(National Institutes of Health, NIH)也参与了这次会议。从明年1月起,基金分配必须包含验证实验所需的抗体和其它关键资源质量的项目。长远的解决方案很可能在明年9月在由全球生物标准研究所(Global Biological Standards Institute)主办的会议上敲定。会议将在加利福尼亚州阿西罗马举行。40年前的这个会议上,科学家们谨慎敲定了利用基因重组技术操控DNA的细则。

美国国立综合医学科学研究所(National Institute of General Medical Sciences)主任Jon Lorsch指出,他们希望,学界能提出一致同意的解决方案。如此这样,基金申请人和基金评委在描述如何认证材料时,都将有据可依。

其中一种解决方案就是使用明确了抗体重要标准的菜单。Uhlén提到,他们关注的,不是抗体的好与坏,而是在特定实验、特定上下文中抗体的效果。 评价体系可能包括利用基因敲减和敲除,来验证在目标蛋白缺乏的情况下,抗体是否仍会发生结合。另一种方法是把靶蛋白带上荧光标签,验证抗体是否会与未标记的蛋白发生结合。还可以把新抗体和质量好的抗体进行比较。最后,研究者可以通过质谱仪来检测分析抗体能与哪些分子结合。  

一些抗体供应商发布了自己的验证结果,新的技术也将有助于抗体质量的验证。英国的生命科学试剂供应商Abcam的首席执行官Alan Hirzel表示,为了验证出售的抗体的质量,该公司使用了可以精细调整DNA的CRISPR–Cas9基因组编辑方法。该公司计划在各种目标基因经CRISPR–Cas9技术切除的人类细胞系中验证抗体,然后把每个抗体的验证结果发布出来。

位于马萨诸塞州沃尔瑟姆的生命科学工具提供商Thermo Fisher Scientific的首席科学官Klaus Lindpaintner指出,现在他们拥有能够验证抗体质量的技术,而5年前、10年前,他们根本没办法做到这点。抗体公司开始把有抗体验证的数据看成是一大竞争优势。今年6月,生命科学公司Bio-Rad发布了一系列经过12种不同细胞系裂解物Western Blot实验验证的抗体。2014年年中以来,抗体公司Proteintech利用小干扰RNA敲除基因的表达,然后验证每一个新抗体产品的信号是否随着蛋白表达的下降而下降。然而,这些努力仍然不够,只有极小一部分公司愿意展开验证工作。

NIH的抗体鉴定项目(Antibody Characterization Program)实验室主任Gordon Whiteley表示,并不是所有的公司都披露具体的测试条件,或何种情况下抗体的表现不佳。抗体鉴定项目的目的是鉴别癌症生物学可靠的抗体清单。他指出,写明测试条件和测试结果同样重要。

抗体生产商Cell Signaling Technology公司的首席科学官Roberto Polakiewicz表示,检测抗体并没有最佳方法。开发一种抗体是一种科学试验。你需要有专业的人士来验证抗体。如果客户不能基于验证结果做出选择,他们会倾向于寻找一种新的抗体。

但研究人员有时只是很草率地扫一眼数据,很多人甚至都没有意识到,抗体在一个特定实验或特定样本中的表现良好,并不意味着它在其它实验里也能表现良好。

此外,正如索尔克研究所(Salk Institute)的神经科学家Paul Sawchenko提醒的那样,商业供应商不能保证一个给定的抗体对每种组织样本都有效。除非碰巧有人在和你一样的样本、一样的实验条件下验证过该抗体的特异性,否则你需要自己去验证这个抗体到底有没有效。

重要信息

加利福尼亚大学(University of California)的信息科学家Anita Bandrowski指出,从其他研究者的论文中得到信息是最高效的方法。但问题是,只有不到一半的实验论文具体描述了试剂使用的抗体货号。即使作者们写明了抗体货号,公司可能会停止出售该产品。Bandrowski是资源识别倡议项目(Resource Identification Initiative,一个NIH支持的、由不同群体的学术合作参与的研究项目)的组长。这一倡议有助于建立一个独特的抗体识别体系,并说服几十种杂志要求作者明确地写明使用的抗体。  

信息开始积累。目前已有十几个专门帮助研究人员选择抗体的网站。一些网站收集用户对抗体性能的评价,并提供比较工具。科学出版社F1000旗下网站Antibody Validation Channel,允许研究人员把自己在抗体购买网站上的账户贴出来,甚至还能请同行针对抗体结果给出意见和建议。Biocompare雇了一个内容编辑,专门联系研究者们,请他们对抗体写评价。

一些抗体供应商,如St John's Laboratory,为研究人员提供使用产品,要求使用者写试用心得。Antibodies-online,一个抗体的网上销售平台,就安排了一个独立的、第三方机构对抗体进行验证。Antibodypedia网站的基因敲减计划于9月推出,该计划里研究者可以通过抗体验证挣到几百美金:免费试用抗体,通过小干扰序列或CRISPR–Cas9等基因沉默技术来验证抗体的信号强度随着蛋白表达的下降而下降,然后把数据提交到网站,就可以坐等网站奖励的几百美金。

但许多科学家都对匿名评论的信息保持警惕。用户和公司提供的数据都很少,一些抗体验证项目只贴出可靠性高的抗体。“有时找个验证机构都比订一个抗体来的简单。”一个抗体网站上的评论写道。

未来的评估

一些研究人员正在研发直接比较抗体的机制。多伦多大学(University of Toronto)的Aled Edwards是国际结构基因组学联盟(Structural Genomics Consortium, SGC)主任。他和他的同事们使用质谱检测和比较1000多种抗体免疫沉淀的蛋白质。该测试由5个参考实验室进行,历时4年,花费了3百万美元,还不算各种人士的好心捐赠。最终,它建立了一个程序来评估抗体质量和提供抗体性能的定量信息,尤其是蛋白沉降实验。在这种实验中,研究人员使用抗体将溶液中的目标蛋白沉淀下来。

挪威奥斯陆大学国家医院(Oslo University Hospital)的蛋白组学专家Fridtjof Lund-Johansen正在开发一个高效的、可同时检测几千种抗体的磁珠试验法。该方法计划将细胞蛋白分离成许多不同的组分,然后用两种不同的方法对每个组分中的蛋白质进行检测分析。一种是质谱法,另一种是基于磁珠阵列、携带几千种抗体的芯片。质谱数据作为参照,用于检测芯片结果。Lund-Johansen也承认,把这个想法变成成品,将需要巨大的前期工作。“这个想法非常大胆,甚至有些疯狂,但这是唯一的途径。”其他科学家对这种方法很感兴趣,但不知道它是否能预测抗体在普通试验中的性能。

瑞典乌普萨拉大学(Uppsala University)的蛋白组学技术开发商Ulf Landegren表示,对抗体的全面评估可能被过分解读。“讨论一种实验中,一种抗体与目的蛋白结合的能力远比讨论抗体是否能与正确的蛋白质以及其它分子结合有意义。”例如,当抗体结合非目的蛋白以外的蛋白时,有可能发生了交叉反应。交叉反应性不仅取决于一个特定的抗体,也取决于样品的复杂性、抗体的浓度和目标蛋白的丰度。他建议,研究人员与其仅仅依赖一个抗体,不如成对地检测能与同一目标蛋白不同部分结合的抗体。与这两种抗体都发生结合的分子不太可能代表非目的蛋白。

这种方法的一个问题是,科学家们很难知道他们购买的抗体到底与哪个部分结合。供应商往往从不同来源获取产品,并且不需要披露原始制造商。因此,想要比较几种抗体的研究人员可能最终会比较由多个供应商销售的相同产品。一些公司,包括Genlogica和One World Laboratories公司只售原厂提供的抗体,并且提供试用装抗体,以便研究者同时测试不同批次的同个抗体。

Edwards表示,最大的挑战不是抗体的验证,而是说服细胞生物学家在抗体完全验证之后再使用抗体,尽管他觉得只有杂志强制要求的情况下,研究者们才会这么做。“现在抗体市场监管不足,产品质量没有保障。”换句话说,只有当研究者们投入精力到抗体的选择上,供应商才会开始提供抗体的验证数据,抗体质量才有保障。


处于困境的抗体市场

同一个抗体在几次实验里得出的结果不同,会产生灾难性的结果。这可能与抗体的生产过程有关。

多克隆抗体是通过收集经过目标抗原刺激免疫的动物的血液而制成的。因此,只要这只动物还活着,就能够一直提供多克隆抗体。为了产生单克隆抗体,宿主动物接受目标蛋白免疫,然后提取出能识别并对该抗原发生响应的B细胞,使其与骨髓瘤细胞发生融合,从而成为可永久培养的细胞,从而不断产生目的抗体。

重组抗体不同于传统的单克隆抗体,因为它们的制备不需要动物。相反,通过确定产生该抗体的基因序列——要么通过对动物的免疫细胞进行测序,要么自己设定序列,检测产生的蛋白是否符合目标。然后将该基因插入到合适的细胞株中,产生抗体。由于抗体是确定的,即使原始细胞株死亡或发生突变,也能通过基因插入,产生需要的细胞株。

出于对抗体质量的追求,两个公共基金资助的项目开始检测市面上销售的抗体和蛋白结合试剂的质量。这两个项目分别是2007年发起的Protein Capture Regeants和2010年发起的Affinomics。目前这两个项目都已接近尾声。支持者表示,某些抗体,例如转录因子的抗体质量格外参差不齐,这些试剂领域的后续投资会取得较高的回报率。

目前多克隆抗体市场份额较大。一项调查发现,2006年以来10000篇生物医学论文引用了1293种多克隆抗体、755种单抗隆抗体和1种重组单克隆抗体。一些研究人员认为,多克隆抗体能以多种方式靶向目标分子,不仅容易制造,而且在不同背景下都能特异性地识别目标蛋白。

Eric McIntush是蒙哥马利Bethyl Laboratories的首席科学官。Bethyl Laboratories已有40多年销售多克隆抗体的经历,计划从2016年起销售重组抗体。他指出,学界对重组抗体也会有需求。公司不可能把资金投入到他们可能永远不卖的产品中。鉴于多克隆抗体的广泛可用性,它是目前研发最便宜的抗体,适用于制备一些研究较少的抗体。但随着目标蛋白结构和功能的不断明确,以及临床转化的需求,重组克隆抗体也将大有可为。

但瑞士苏黎世大学(University of Zurich)蛋白质工程学家Andreas Plückthu等人认为,单克隆抗体和多克隆抗体最终会被结构更明确的重组抗体完全取代。他同意,许多蛋白质不能被现有的试剂识别,但这并不是使用结构不明确的多克隆抗体的理由。“为什么不使用一些基因可识别或存储的试剂呢?”

(力太生物.com)

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